QUY TRÌNH PHÁT HIỆN VI RÚT DỊCH TẢ LỢN CHÂU PHI BẰNG KỸ THUẬT REALTIME PCR.

Bệnh dịch tả lợn Châu Phi (African Swine Fever) Bệnh dịch tả lợn Châu Phi là bệnh gây ra bởi vi rút DNA sợi đôi thuộc họ Asfarviridae, giống Asfivirus. Thời gian ủ bệnh trong tự nhiên thường 4-19 ngày. Các chủng vi-rút độc lực gây xuất huyết bán cấp tính và cấp tính với các đặc điểm sốt cao, bỏ ăn uống, xuất huyết ở da và các cơ quan nội tạng, chết trong vòng 4-10 ngày, đôi khi chết ngay cả trước khi có dấu hiệu lâm sàng đầu tiên. Tỷ lệ tử vong có thể lên đến 100%. Các chủng độc lực thấp hơn có triệu chứng lâm sàng nhẹ như sốt nhẹ, giảm ăn và mệt mỏi – dễ bị nhầm lẫn với một số tình trạng bệnh lý khác ở lợn.

Ảnh minh họa bệnh Dịch tả lợn Châu Phi

Hiện tại theo TCVN XXXX:2018 do Chi cục Thú y Vùng VI- Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố "Phương pháp xét nghiệm Reatime PCR là tiêu chuẩn vàng trong Qui trình chuẩn đoán bệnh"

QUI TRÌNH - PHƯƠNG PHÁP REATIME PCR TRONG XÉT NGHIỆM ASF

1. Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, sử dụng nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác.

2.1. Thuốc thử và vật liệu cho lấy mẫu

2.1.1 Ethanol, từ 70% (thể tích) đến ethanol tuyệt đối

2.1.2 Dung dịch muối đệm phosphat (PBS), pH 7,2±0,2 (Phụ lục A1)

2.1.3 Tăm bông vô trùng

2.1.4 Xy lanh và kim tiêm loại 22G

2.2. Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho Realtime PCR

2.2.1 Kít chiết tách RNA/DNA

2.2.2 Kít nhân gen

2.2.3 Mồi xuôi, mồi ngược và mẫu dò

2.2.4 Mẫu chuẩn dương được chứng nhận dương tính hoặc DNA chuẩn dương tính tách chiết từ vi rút ASF có giá trị Ct (chu kỳ ngưỡng đã biết trước)

2.2.5 Nước tinh khiết, không có DNase/RNase

2.2.6 Ethanol tuyệt đối

3. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thí nghiệm sinh học và cụ thể như sau:

HỆ THỐNG THIẾT BỊ PHÒNG SINH HỌC PHÂN TỬ, CHUẨN ĐOÁN BỆNH


STT

Danh mục thiết bị/hóa chất/dụng cụ

Xuất xứ

Đơn vị tính

Số lượng

I

Khu Vực tách chiết, chuẩn bị mẫu

1

TỦ AN TOÀN SINH HỌC CẤP 2

Model: PURICUBE - 1200

Hãng: NOVAPRO - Hàn Quốc

Xuất xứ: Hàn Quốc

Thông số chính:
- Tủ Class II, loại A2 bảo vệ an toàn cho người thao tác, mẫu vật và môi trường.
- Chiều rộng khoang làm việc: 1200 mm
- Mặt bàn làm việc được làm bằng Inox
- Kích thước trong (Dài Rộng x Cao): 1200 x 530 x 680 mm

- Kích thước ngoài (dài x rộng x cao): 1260 x 800 x 1990 mm

- Tỷ lệ khí: 70% lọc tuần hoàn qua màng lọc HEPA ; 30% khí xả ra ngoài môi trường qua màng lọc HEPA
- Dòng khí sẽ đi qua màng lọc thô loại bỏ các hạt 3 - 30µm
- Hệ thống màng lọc HEPA hiệu năng lọc cao đạt 99.993 % cho các hạt có kích thước 0.3 micromet
- Đèn huỳnh quang chiếu sáng khoang thao tác, công suất: 30W x 2
- Đèn UV tiệt trùng công suất: 30W x 1
- Nguồn điện: 220VAC/50Hz/60Hz

Hàn Quốc

Chiếc

1

2

Máy ly tâm đa năng bao gồm 2 rotor

( 1 rotor tách mẫu, huyết thanh, 1 rotor tách DNA/RNA)

Model: Sigma 2-16P

Hãngsảnxuất: Sigma Centrifuge – Đức

Thông số kỹ thuật

Tốc độ ly tâm tới 15,300 rpm. Bước nhảy: 100 rpm

Dung tích tối đa:4 x 100 ml

Rotor có sẵn: 17 rotor

Thời gian tăng tốc: 15 giây với Rotor văng 11170 với buckets 13299 và nắp.

Thời gian giảm tốc: 15 giây với Rotor văng 11170 với buckets 13299 và nắp.

Có 10 bước gia tốc và giảm tốc.

Thời gian ly tâm: 10 giây đến 99:59 phút hoặc liênt ục

Nhiệt độ cài đặt: đến +40 độ C

Mức độ ồn: ≤ 53 dB (A) với Rotor 12141

Cung cấp bao gồm

Sigma Centrifuge – Đức

 

Chiếc

1

3

BLOCK GIA NHIỆT KHÔ VÀ LẠNH

Model:  HB-R48-Set

Hãng Sản Xuất: DAIHAN –  ( Xuất xứ: HQ)

Thông số kỹ thuật

Dung tích: 48 ví trí x ống ly tâm 1,5/2.0 ml

Công suất gia nhiệt: 300W; Sensor PT100

Cooling: Two Peltier Modules

Dải nhiệt độ: -5℃~ 95℃

Độ chính xác : ± 0,1℃ ở 37℃, ± 0.2℃ ở 90℃

Tốc độ gia nhiệt: khoảng 5℃/phút

An toàn mạch: Bảo vệ nhiệt độ quá tải/ Bảo vệ quá dòng Phát hiện lỗi cảm biến

Hẹn giờ lên đến 99 giờ 59 phút (trễ và tiếp tục chạy), báo lỗi và đặt giờ kết thúc

Màn hình hiển thị LCD với chức năng Back - Light

Vật liệu bên trong và bên ngoài: Thép không gỉ và thép sơn tĩnh điện

Vật liệu block: Anodized Aluminum

Kích thước và trọng lượng khi vận chuyển và đóng gói: 350×220×h310mm, 9 kg

Công suất tiêu thụ: 450W

Nguồn điện: 1 pha, AC 230V, 50/60Hz.

Hàn Quốc

Chiếc

1

4

MÁY LY TÂM MiniSpin

CatNo: CSLQSPIN

Hãng sản xuất: Cleaver Scientific – Anh

Dung tích:   Rotor: 6 ống x 1.5/2.0mL

                  Strips: 2 ống x 0.2mL

Tốc độ Rotor max: 6000 vòng/phút

RFC: 2000 x G

Kích thước: 15 x 15 x 11.7 cm

Trọng lượng: 0.45 kg

Nguồn điện: 230V/ 50/60Hz

Cleaver Scientific – Anh

 

Chiếc

1

5

Hệ thống tách axit nucleic (DNA/RNA) tự động

Tên máy: LiliF™ Miracle-AutoXT

Model: INT-50104

Hãng sản xuất: iNtRON Biotechnolgy –Hàn Quốc

Xuất xứ: Hàn Quốc

Cấu hình cung cấp:

  • Máy chính: 01 chiếc
  • Phụ kiện tiêu chuẩn:
  • Tài liệu hướng dẫn sử dụng tiếng Anh và tiếng Việt: 01 bộ
  • Tài liệu hướng dẫn bảo dưỡng sửa chữa: 01 bộ

Thông số kỹ thuật

Chứng nhận: CE/ IVD product quality liability insurance

Thể tích phản ứng:1-200 µl

Dung lượng mẫu:1 – 32 mẫu / lần chạy

Khả năng lưu giữ của hạt từ:≥ 99%

Tính đồng nhất sau tinh sạch: Cv < 3%

Khử nhiễm: Đèn UV

Loại kit tương thích:Kit sử dụng công nghệ hạt từ tính

Thời gian thực hiện 20-45’

Hệ điều khiển Màn hình LCD Socket,USB, RS232, Bluetooth, WIFI

Chương trình cài đặt, chỉnh sửa, xóa chương trình; tự do cài đặt chương trình chạy

Kích thước 340 x 420 x 345 mm

Khối lượng tịnh 24 kg

Nguồn AC100 ~ 240V 50Hz/60Hz 600W

Khoảng nhiệt độ hoạt động: 10oC ~ 40oC

Khoảng độ ẩm hoạt động: 10% ~ 85%

Hàn Quốc

HT

1

II

Khu vực chuẩn đoán , máy Realtime PCR

1

Hệ thống Định lượng Realtime PCR

  • Năm sản xuất: Từ 2019 trở lại đây
  • Đạt chứng chỉ: ISO 13485-2016, ISO 9001-2015,
  • Đạt tiêu chuẩn IVD Medical Equipment (E.A.R- Certificate)
  • Chất lượng: Mới 100%
  • Bảo hành: 12 tháng
  • Nguồn điện sử dụng: 100 ~ 240 VCA, 50/ 60Hz
  • Điều kiện làm việc tối đa: Nhiệt độ 300C; độ ẩm từ 80%

1.1 Cấu hình

-Máy chính và phụ kiện tiêu chuẩn

-Phần mềm điều khiển và phân tích

-Tài liệu kỹ thuật, sách hướng dẫn sử dụng

-Hệ thống máy vi tính: CPU Intel, màn hình LCD

- 01 Bộ kít định lượng ASF

- vật tư tiêu hao ống 1.5ml, ống 0,2ml, típ có lọc 10ul, 200ul, 1000ul

1.2 đặc tinh kỹ thuật

Cấu hình Block : Tấm PCR 96 giếng (12 x 8) x0.2 ml

Loại ống nghiệm: ống PCR 0.2-ml (riêng biệt, trong dải 8 hoặc 96-bit PCR microplate (12x8))

Nhiệt độ của block: 0 ~ 100° C, thích hợp cho quá trình ủ nhiệt ở 37oC của phản ứng Reverse transcriptase PCR

Độ Phân giải nhiệt độ: 0.1° C

Độ chính xác nhiệt độ: +/- 0,2° C

Nhiệt độ không đều nhiệt độ tối đa: 0.3 (+/- 0.15) ° C

Tốc độ gia nhiệt, trung bình (tối đa): 3.3 (3.5) ° C / s

Tốc độ làm mát, trung bình (tối đa): 2.1 ° C / s

Thiết bị làm nóng / làm lạnh hoạt động của block: Peltier

  • Nguồn đèn sử dụng: đèn LED, tuổi thọ 100,000 giờ. Hệ thống không cần Calibration máy

Đầu đọc tín hiệu: CCD camera, giúp phân tích mẫu đồng đều

Số kênh màu 5 kênh,(Sử dụng 5 bộ kính lọc (phát xạ/kích thích)): 470/525nm (FAM /Green); 530/560nm (HEX/JOX/Yellow); 580/630nm (ROX/Tesared/Orange), 630/660nm (Cy5/Red), 687/731nm (Cy5.5 Crimson/Quasar705)

Bước sóng phát hiện: 470-750nm.

Nhiệt độ nắp: 105° C

  • Phát hiện Mutiplex 5 đối tượng trong một tube

Kích thước (Rộng x Dài x Cao): 210 x 540 x 540 mm

  • Đặc biệt ứng dụng rộng rãi trong xét nghiệm chuẩn đoán bệnh virut vi khuẩn
  • phân tích đường cong nóng chảy (melting curve)
  • phân tích sự biểu hiện gen (gene expression)

Các đặc điểm chung

-Sử dụng cho chức năng real-time PCR hoặc PCR thông thường

-Hệ thống mở, có thể sử dụng tất cả các loại hóa chất có sẵn

-Chế độ tự kiểm tra chất lượng tích hợp sẵn trong máy

-chế độ hotline của hãng trực tiếp trong quá trình chạy máy

  • - Bộ vi điều khiển và hiển thị cho phép thực hiện các chương trình mà không cần giám sát trực tiếp. Ngoài ra, thiết bị sẽ tiếp tục thực hiện chương trình trong trường hợp mất điện hoặc tắt máy bất ngờ;
  • Vận hành tự động.
  • -Phần mềm cho phép điều khiển tự động, thu nhận và đồng bộ dữ liệu, phân tích, biện luận kết quả, kết nối với các phần mềm khác (LIMS)
  • -Hiển thị đường chuẩn, định lượng số lượng DNA đích trong mẫu

-Người sử dụng có thể tự vệ sinh các module quang học

  • -Phát hiện huỳnh quang 5 kênh cho một loạt các thuốc nhuộm huỳnh quang trong khoảng quang phổ rộng bao gồm Hex, Fam, Cy5, Rox và kênh thứ 5 theo yêu cầu của khách hàng;

Độ nhạy cao, tỷ lệ tín hiệu / nhiễu tối ưu và độ nhiễu thấp bởi thiết kế quang học bao gồm nguồn sáng riêng cho từng kênh và một máy ảnh CCD

Máy tính:

  • Máy tính labtop hãng Dell
  • Màn hình LED HD 15.6inch

DNA TECH - Nga

HT

1

2

Pipette chuyên dụng dùng trong SHPT

Hãng sản xuất: Cleaver-Anh

- Đạt các chứng chỉ xét nghiệm IvD conform và TUV

- Phần dưới của Pipet có thể tháo rời và khử trùng ướt được ở 120°C trong 20 phút

- Có hai nấc nhấn

- Hiển thị bốn số.

* Một bộ pipette gồm 4 chiếc (bao gồm giá đỡ)

- Pipet dung tích 0.5 - 10 ul

- Pipet dung tích 2 - 20 ul

- Pipet dung tích 20 - 200 ul

- Pipet dung tích 100 - 1000 ul

Cleaver-Anh

Bộ

1

3

Máy Vortexer VX1

CatNo: VX1

Hãng sản xuất: Nippon Genetics - Nhật Bản

Votexer này có thể hoạt động ở 2 chế độ khác nhau:

1.      Chế độ chạm – chức năng rung bắt đầu khi một lượng nhỏ của áp suất tác động tới cốc cao su, có thể thay đổi tần số rung.

2.      Chế độ lien tục - các phụ kiện mở rộng có sẵn để sử dụng trong chế độ liên tục tạo ra giải pháp lý tưởng cho một loạt lớn các nhu cầu đa dạng của thiết bị .

Thông số kỹ thuật:

Nguyên vật liệu cấu tạo: hợp kim kẽm và technopolymer

Hệ thống hỗ trợ: 3 chân chống trượt

Kiểu chuyển động: quỹ đạo

Đường kính quỹ đạo : 4,5 mm

Chế độ hoạt động: chạm / liên tục

Cài đặt tốc độ : tương tự

Tốc độ: 0-3000 vòng/ phút

Nippon Genetics - Nhật Bản

chiếc

2

 

 

Hóa chất Vật Tư:

TT

Miêu tả

Xuất xứ

Đơn vị tính

 SL

1

Ống ly tâm 1.7ml

Biologix

hộp/500c

10

2

Đầu côn xanh 1000 µl

Biologix

túi/1000c

10

3

Đầu côn vàng 200µl

Biologix

túi/1000c

10

4

Đầu côn trắng  10µl

Biologix

túi/1000c

10

5

Găng không bột

Malaisia

hộp/100c

10

6

Bơm tiêm 5ml

vinahankook

hộp/100c

10

7

Ống ly tâm nhựa 15ml

Biologix

túi/50c

10

8

Đầu côn có lọc 1000µl

Biologix

hộp/96 típ

100

9

Đầu côn có lọc 200µl

Biologix

hộp/96 típ

100

10

Đầu côn có lọc 10µl

Biologix

hộp/96 típ

100

11

AutoXT PGS DNA/RNA Kit
CATNO:17168-48
KIT TACH DNA/RNA

iNtRon

hộp/50 rea

1

12

African swine fever virus

Catalogue no: Z-Path-ASFV

Catalogue no: Z-Path-ASFV-std

Ideal Accompanying Reagent: oasig lyophilised 2x qPCR MasterMix Kit: 150 reaction kit

Primer-Anh

150 reaction kit

1

 

Hệ Thống thiết bị theo tiêu chuẩn CE-IVD

 

QUI TRÌNH CƠ BẢN

1 Tách chiết DNA

- Sử dụng kít chiết tách DNA cho vi-rút dịch tả lợn Châu phi theo hướng dẫn của nhà sản xuất theo kít chiết tách PGS Virus DNA/RNA – iNtRON Biotechnology – Hàn Quốc. Hoặc có thể sử dụng các loại kít chiết tách tương đương, phù hợp cho chiết tách DNA vi rút (Tham khảo Phụ lục B).

- Huyễn dịch bệnh phẩm sau khi được thực hiện tách chiết DNA bằng các kít thương mại và bảo quản mẫu DNA ở 40C nếu xét nghiệm ngay, hoặc bảo quản -200C trong thời gian dài.

2 Chuẩn bị mồi

- Phản ứng realtime PCR sử dụng cặp mồi xuôi, mồi ngược và đoạn dò được nêu trong Bảng C1, phụ lục C với nồng độ thích hợp.

+ Mồi sử dụng ở nồng độ 20 µM

+ Đoạn dò sử dụng ở nồng độ 5 µM

3 Tiến hành phản ứng realtime PCR

- Sử dụng cặp mồi đã chuẩn bị (6.3.2.2) và bộ kít thương mại, pha hỗn hợp phản ứng (Master mix) và cài đặt chu trình nhiệt theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Lượng hỗn hợp nhân gen dùng cho 1 phản ứng được nếu trong Bảng C2, phụ lục C.

- Sau khi chuẩn bị xong nguyên liệu Master mix tiến hành:

+ Cho 20 µl hỗn hợp Master mix vào ống PCR 0,2 ml.

+ Cho 5 µl DNA dương chuẩn của vi rút ASF có giá trị Ct đã biết trước vào ống PCR đối chứng dương

+ Cho 5 µl nước tinh khiết, không có nuclease vào ống PCR đối chứng âm

+ Cho 5 µl DNA của mẫu vừa tách chiết vào ống PCR

+ Đặt ống PCR vào máy realtime PCR

Lưu ý: Phản ứng realtime PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu đối chứng dương và mẫu đối chứng âm.

- Chu trình nhiệt chạy phản ứng được nêu trong Bảng C3, phụ lục C.

Chú thích: Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng realtime PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

4 Đọc kết quả

- Kết quả của phản ứng real-time PCR được xác định dựa vào chu kỳ ngưỡng (Cycle threshold: Ct).

- Phản ứng được công nhận khi: mẫu đối chứng dương tính (được chuẩn độ trước) phải có giá trị Ct tương đương giá trị Ct đã biết (± 2 Ct), mẫu đối chứng âm không có Ct.

- Với điều kiện phản ứng:

+ Mẫu dương tính khi giá trị Ct < 40

+ Mẫu âm tính khi không có giá trị Ct

+ Mẫu nghi ngờ khi giá trị 40 ≤ Ct ≤ 45.

Phân tích và đọc kết quả bằng Máy realtime PCR - Hãng DNA Technology - Nga.

Nhà phân phối độc quyền tại Việt Nam: Công ty BDE

- Đánh giá kết quả: Mẫu có vi rút gây bệnh dịch tả lợn Châu phi khi kết quả real-time PCR dương tính. Với những mẫu nghi ngờ cần được thực hiện lại xét nghiệm hoặc sử dụng phương pháp xét nghiệm khác để khẳng định kết quả.

Nhóm chuyên gia BDE | Tham khảo thêm TCVN XXXX:2018

Để biết thêm chi tiết, Quý khách hàng vui lòng liên hệ:

Công ty TNHH Thiết Bị B.D.E

​Số 44, TT 3 - Khu Đô Thị Văn Phú  - Hà Đông - Hà Nội

Tel : 02466 807 528          Fax 0433 513 114

Email : info@bde.vn

Hotline 097 664 11 99

Website: www.bde.vn