Quy trình giải phẫu bệnh

I. QUÁ TRÌNH PHẪU TÍCH BỆNH PHẨM

1. NGUYÊN TẮC

Quá trình phẫu bệnh phẩm được dùng để phân tách các bộ phận, tìm hiểu hình thái và sự liên quan đến các vùng lân cận của mô cần phân tách. Với các bệnh phẩm, để chẩn đoán mô bệnh học, cần sử dụng toàn bộ, không cắt nát bệnh phẩm và không làm dập bệnh phẩm bằng các dụng cụ pha bệnh phẩm. Bệnh phẩm cần được cố định ngay (không quá 30 phút kể từ khi bệnh phẩm được lấy ra khỏi cơ thể) trong formol đệm trung tính 10%.

2. Thiết bị, hóa chất

- Bàn phẫu tích bệnh phẩm: Kích thước 150cm x 120cm x 80cm, chiều cao có thể thay đổi để thích hợp cho tư thế đứng pha bệnh phẩm.

- Giá đựng bệnh phẩm lưu trữ nhiều tầng: 01 cái, kích thước 200cm x 60cm x 200 cm (kích thước có thể thay đổi cho phù hợp với diện tích của phòng phẫu tích bệnh phẩm, chiều cao mỗi ngăn nên từ 40cm-50cm).

- Dao sắc có chuôi cầm: 02 cái, dao lưỡi mỏng: 02 cái.

- Kẹp phẫu tích có mấu và không mấu: Mỗi loại 02 cái có chiều dài khác nhau.

- Thớt nhựa phẳng: 02 cái.

- Các lọ chứa dung dịch formol đệm trung tính 10% để đựng bệnh phẩm, số lượng lọ có dung dịch cố định phụ thuộc vào số lượng mẫu cần lấy (mỗi mẫu 01 lọ). Lượng dung dịch cố định phải lớn hơn 20 lần thể tích bệnh phẩm cố định.

- Bút chì mềm, nhãn giấy ghi tên, tuổi Người bệnh, mã số xét nghiệm, mô xét nghiệm…

- Khuôn nhựa đựng bệnh phẩm.

- Găng tay, khẩu trang, kính bảo vệ mắt và quần áo bảo hộ: 03 bộ.

- Vòi nước chảy, các dụng cụ và thuốc tẩy trùng để làm sạch dụng cụ.

- Bình có chứa dung dịch cố định để lưu bệnh phẩm xét nghiệm thêm.

- Dụng cụ có nắp kín để đựng các bệnh phẩm đã pha còn dư lại để đem huỷ.

- Có phần mô tả đại thể, số lượng bệnh phẩm lấy xét nghiệm, vùng lấy bệnh   phẩm, loại mô xét nghiệm…

3. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

a. Quy trình chuẩn bị

Bệnh phẩm từ các khoa, phòng lâm sàng gửi tới được đựng trong dung dịch formol đệm trung tính 10% (cố định tại chỗ ngay sau khi sinh thiết), hoặc gửi ngay tới khoa giải phẫu bệnh, không gói bệnh phẩm trong gạc vì sẽ làm khô bệnh phẩm.

- Dùng kẹp không có mấu lấy mẫu mô khỏi dung dịch cố định. Nếu mẫu mô dài, không cắt ngang mẫu mô mà cuộn lại trong khuôn nhựa (cassette).

- Xem xét kỹ lọ chứa và bên dưới nắp lọ để không bỏ sót những mảnh mô nhỏ.

- Dùng 1 túi lọc bọc mẫu mô lại.

- Nếu lõi mô dài >1cm hoặc có 2 lõi mô và nếu có dự tính sẽ nhuộm mỡ, nên lưu trữ 1 mẫu 3-5 mm trong formol đệm trung tính 10%.

b.  Mô tả đại thể

- Loại mô xét nghiệm

- Vùng lấy bệnh phẩm

- Số lượng bệnh phẩm lấy xét nghiệm

- Màu sắc bệnh phẩm

- Kích thước bệnh phẩm

- Đặc điểm hình thái khác: mật độ …

- Cắt lọc bệnh phẩm xét nghiệm mô bệnh học: Dùng tất cả mẫu bệnh phẩm nhận được (ngoại trừ khi có nhuộm mỡ).

4. Yêu cầu phẫu tích

Các mẫu mô được lấy toàn bộ, không bị vụn nát, không bị hoại tử, cố định ngay trong formol đệm trung tính 10%.

II. QUÁ TRÌNH XỬ LÝ MÔ.

 1.   NGUYÊN LÝ

Cố định mới chỉ giết chết tế bào và giữ cho các thành phần của chúng đựơc bất động ở trạng thái tĩnh. Nếu đem cắt ngay thành các lát cắt mỏng, mối liên quan giữa các tế bào cũng như cấu trúc mô bị biến đổi, thậm chí đảo lộn do tác động cơ học. Giải quyết vấn đề này cần có một chất làm nền cho bệnh  phẩm, có tác dụng như một khuôn giữ vững bệnh phẩm, đồng thời thâm nhập được vào bên trong tế bào, giữ cho các tế bào yên vị khi cắt mảnh. Đây chính là nguyên lý của vùi bệnh phẩm. Chất vùi bệnh phẩm phải đạt các yêu cầu sau: mềm, dễ ngấm, dễ cắt, nhiệt độ nóng chảy thấp, dễ loại bỏ. Parafin là chất thỏa mãn tất cả các yêu cầu trên. Hiện có nhiều loại parafin với các điểm nóng chảy khác nhau nhưng loại phù hợp nhất với kỹ thuật mô bệnh học là loại có độ nóng chảy từ 56-58 độ. Nếu nhiệt độ nóng chảy cao sẽ phải chỉnh nhiệt độ của tủ parafin lên cao, do vậy, làm bệnh phẩm quá chín sẽ khó cắt và bắt thuốc nhuộm kém. Người ta còn cho thêm vào parafin một số chất phụ gia để tăng chất lượng của nó như: Histoplast, paraplast..

2) Thiết bị, hóa chất cần dùng.

+ Bể parafin có nhiệt độ từ 56-58 độ.

+ Các khay, hộp thép không rỉ đựng parafin.

+ Parafin, sáp

+ Cồn 90-1000.

+ Xylen hay Toluen.

+ Găng tay, khẩu trang, kính bảo vệ mắt và quần áo bảo hộ.

+ Vòi nước chảy, các dụng cụ và thuốc tẩy trùng để làm sạch dụng cụ.

3 Quy trình thực hiện

Cho bệnh phẩm lần lượt đi qua các loại hóa chất sau:

* Bệnh phẩm <2mm

-                 Cồn 90 độ                           15 phút

-                 Cồn 95 độ                           15 phút

-                 Cồn 100 độ (I)                    15 phút

-                 Cồn 100 độ (II)                   30 phút

-                 Cồn 100 độ (III)                  30 phút

-                 Toluen (I)                            15 phút

-                 Toluen (II)                           30 phút

-                 Toluen (III)                          30 phút

-                 Parafin (I)                            30 phút

-                 Parafin (II)                           1 giờ

-                 Parafin (III)                         1 giờ

* Bệnh phẩm 5mm -<8mm

-                 Cồn 80 độ                           2 giờ

-                 Cồn 90 độ                           6 giờ

-                 Cồn 95 độ                           8 giờ

-                 Cồn 100 độ (I)                    4 giờ

-                 Cồn 100 độ (II)                   6 giờ

-                 Cồn 100 độ (III)                  8 giờ

-                 Toluen (I)                            4 giờ

-                 Toluen (II)                           8 giờ

-                 Toluen (III)                          8 giờ

-                 Parafin (I)                            4 giờ

-                 Parafin (II)                           6 giờ

-                 Parafin (III)                         10 giờ

 Khử nước

+ Parafin không tan trong nước nên không thể ngấm vào bệnh phẩm nếu còn nước. Chất để khử nước trong bệnh phẩm hay dùng nhất là cồn etylic.

+ Lượng cồn để khử nước gấp 10 lần thể tích bệnh phẩm với 4 lần ngâm.

+ Thời gian khử nước 4 giờ cho mỗi nồng độ cồn.

b.                      Tẩm dung môi trung gian của parafin (khử cồn)

+ Ngâm bệnh phẩm trong toluen hoặc xylen 180 phút.

c.                       Tẩm parafin (khử xylen)

+ Chuyển bệnh phẩm qua 2-3 lần parafin.

+ Thời gian chuyển trong parafin khoảng 180 phút.

III. KỸ THUẬT ĐÚC KHỐI PARAFIN

1,  NGUYÊN LÝ

Đúc khối là làm cho parafin ở xung quanh cũng như ở bên trong bệnh phẩm đặc lại thành một khối thuần nhất. Để đạt được điều này, người ta dùng những khuôn bằng kim loại để dẫn nhiệt và nước lạnh có đá. Đúc bệnh phẩm phải thao tác nhanh sao cho nhiệt độ của parafin và bệnh phẩm không chênh  lệch nhiều. Nếu nhiệt độ parafin hay bệnh phẩm quá chênh lệch, sẽ tạo ra một viền trắng quanh bệnh phẩm, khi khối parafin nguội hay khi cắt, bệnh phẩm có thể bật ra khỏi khối. Mặt khác, bệnh phẩm phải được đặt đúng hướng để các mảnh cắt có đầy đủ các thành phần của mô cần khảo sát.

2. Thiết bị, hóa chất

+ Tủ parafin có nhiệt độ từ 56-58 độ.

+ Các khay, hộp thép không rỉ đựng parafin.

+ Parafin chuyên dụng

+ Khuôn nhựa ghi mã Người bệnh hoặc giấy ghi mã Người bệnh bằng bút chì mềm.

+ Dụng cụ làm lạnh (khay đá hoặc bàn làm lạnh bằng điện)

+ Khuôn đúc kim loại bằng thép không rỉ.

+ Găng tay, khẩu trang, kính bảo vệ mắt và quần áo bảo hộ.

+ Vòi nước chảy, các dụng cụ và thuốc tẩy trùng để làm sạch dụng cụ

3. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Qui trình chuẩn bị

+ Bệnh phẩm đã vùi trong parafin đủ thời gian.

+ Sắp khuôn kim loại trên mặt phẳng (nếu đúc bằng tay).

+ Khuôn kim loại bằng thép không rỉ đặt trong ngăn nóng, khuôn nhựa, bàn làm lạnh hoặc khay đá lạnh (nếu đúc bằng máy).

Cách tiến hành

+ Đặt khuôn bằng kim loại trên mặt phẳng, rót parafin nóng chảy vào khuôn hoặc đặt khuôn dưới vòi rót parafin (nếu đúc bằng máy), rót parafin vào khuôn.

+ Đặt bệnh phẩm vào khuôn theo mặt phẳng đúng yêu cầu (bệnh phẩm sát mặt đáy, định hướng đúng chiều bệnh phẩm). Gắn khuôn nhựa lên trên.

+ Để nguội và dỡ khuôn hoặc chuyển sang bàn làm lạnh.

Lưu ý: Người ta chọn mặt phẳng cắt là mặt đáy. Với các bệnh phẩm quá nhỏ, có thể dùng kính lúp để nhặt và đặt bệnh phẩm hoặc nhuộm bệnh phẩm với eosin 1% cho dễ nhận biết.

IV. KỸ THUẬT CẮT MẢNH BỆNH PHẨM ĐƯỢC ĐÚC TRONG PARAFIN

 1. NGUYÊN LÝ

Chỉ có thể quan sát chi tiết hình thái tế bào và mô dưới kính hiển vi quang học sau khi nhuộm màu, nếu các mảnh bệnh phẩm có độ dầy <5µm. Vì vậy, với các mảnh bệnh phẩm có độ dầy 5-10 mm trong các khối parafin, phải tiến hành cắt các bệnh phẩm này thành các mảnh cắt có độ dầy từ 3-4 µm bằng máy (dao) cắt lát mỏng chuyên dụng để có thể tiến hành các công đoạn kỹ thuật tiếp theo.

2. Thiết bị, hóa chất

+ Lưỡi dao cắt: Thường là loại dùng 1 lần, có 2 loại khác nhau:

*           Lưỡi dao vát 350 dùng cho các mảnh cắt thông thường, kể cả mô xương

*           Lưỡi dao vát 220 dùng cho các mảnh cắt cần rất mỏng (0,5-1µm).

+ Máy cắt lát mỏng: Cần kiểm tra các ốc vít và tra dầu bôi trơn.

+ Que tãi bệnh phẩm.

+ Phiến kính sạch.

+ Dung dịch albumin.

+ Bút viết kính.

+ Bể nước dàn bệnh phẩm ở 50- 60 ^oC (bể chuyên dụng hoặc có thể sử dụng nồi nấu lẩu để ở mức nhiệt thấp nhất).

+ Phòng cắt: Nhiệt độ phòng cắt khoảng 250, cần có máy điều hoà nhiệt độ.

3.Các bước tiến hành

a. Chuẩn bị dung dịch albumin

Albumin dự trữ

+ Lòng trắng trứng:                     1 thể tích.

+ Glyxerin nguyên chất:             1 thể tích

+ Thymol:                                   1 vài tinh thể (chống thối rữa)

Khuấy đều cho tới khi lòng trắng trứng và glyxerin hòa tan hoàn toàn. Lọc và bảo quản ở 40C trong lọ nút kín.

Albumin khi dùng

+ Albumin dự trữ:                       2ml

+ Nước cất:                                  98ml

Trộn đều và dùng, không để nóng >50 ^oC.

Albumin dạng hạt bán sẵn: Pha với nước cất ở nồng độ không quá 2%. Pha đủ dùng để tránh lãng phí vì khi dùng không hết phải bỏ đi.

b. Các bước tiến hành

-      Gá khối parafin lên máy cắt, vặn chặt để không bị bong bật khi cắt.

-      Lắp dao lên máy cắt, chỉnh độ nghiêng của lưỡi dao khoảng 450.

-      Điều chỉnh độ dầy, mỏng của mảnh cắt theo ý muốn.

-      Quay vô lăng đều, nhẹ nhàng, loại bỏ những lát cắt đầu tiên (cắt phá). Lưu ý: Khi cắt phá, nên sử dụng dao cắt ở phần ngoài, đến khi cắt lấy bệnh phẩm để nhuộm sẽ dùng phần dao ở giữa (không dùng lưỡi dao ở phần cắt phá).

-       Chỉnh độ dầy lát cắt khoảng 3-4µm, dịch chuyển lưới dao về vị trí trung tâm. Lấy các lát cắt đạt tiêu chuẩn (mỏng đều, không rách, không xước, không nhăn và lấy hết mặt bệnh phẩm).

-        Dùng que tãi, đưa nhẹ nhàng các lát cắt vào phiến kính (có mã số của bệnh phẩm) đã nhúng qua albumin, đặt lên bàn hơ hoặc thả các lát cắt vào khay nước ấm, để mảnh cắt dãn đều rồi vớt mảnh cắt, đặt lên phiến kính đã phủ albumin.

-             Dựng tiêu bản trên giá đựng tiêu bản.

-             Đưa tiêu bản vào tủ ấm 37^o.

4. Yêu cầu của mẫu bệnh phẩm sau khi cắt

Bệnh phẩm mỏng đều, không xước, không gấp hoặc bị rách.

Còn nguyên parafin quanh bệnh phẩm.

Vị trí của mảnh cắt ở 2/3 phía ngoài của phiến kính.

Kích thước của mảnh cắt tương đương kích thước thật của bệnh phẩm đã pha.

V. KỸ THUẬT CẮT LẠNH MẢNH MÔ

 1. NGUYÊN LÝ

Là phương pháp xét nghiệm mô bệnh học nhanh, thường được áp dụng trong phẫu thuật. Mặt khác, các lát cắt lạnh còn có thể dùng để nhuộm một số kỹ thuật đặc biệt như nhuộm mỡ... Khi mẫu mô được làm lạnh, nước ở trong mô chuyển thành đá và đóng vai trò như chất trung gian giữ hình dạng (khung) của mô, vì thế mô trở nên cứng và có thể cắt mỏng được.

2.Thiết bị, hoá chất

-  Máy cắt lạnh đang ở trạng thái hoạt động.

-  Dao sắc, thớt  nhựa sạch, phẳng.

-  Bộ dụng cụ phẫu tích bệnh phẩm.

-  Phiến kính, lá kính sạch.

-  Bút chì mềm (để ghi tên tuổi Người bệnh, mã số tiêu bản trên phiến kính).

-  Giấy thấm, gạc sạch.

-  Găng tay, khẩu trang, mũ, kính bảo vệ mắt và quần áo bảo hộ.

-  Chổi lông mềm.

-  Gel cắt lạnh.

-  Cồn tuyệt đối.

-  Thuốc nhuộm: Các thuốc nhuộm thông thường như Hematoxylin Eosin hoặc xanh Toluidin hoặc Diff-quick...Đối với các mảnh cắt lạnh cần nhuộm đặc biệt

3. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Quy trình chuẩn bị

-  Bệnh phẩm sau khi lấy ra từ BN được gửi ngay đến khoa giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học.

-  Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học tiếp nhận, ghi các thông tin về Người bệnh vào sổ đăng ký và mã số Người bệnh.

-  Ghi mã số của Người bệnh vào phiến kính và dán mã số vào hộp đựng bệnh phẩm.

Cắt lọc bệnh phẩm

-  Bác sĩ giải phẫu bệnh quan sát bệnh phẩm, mô tả kỹ về loại bệnh phẩm, số lượng, đo kích thước, màu sắc, tính chất, mặt cắt… của bệnh phẩm, xác định vùng tổn thương cần lấy mẫu cắt lạnh.

-  Động tác lấy bệnh phẩm phải nhẹ nhàng, tránh gây dập nát hay biến đổi do tác động cơ học.

-  Không kẹp vào vùng định lấy mẫu xét nghiệm, không rửa mẫu mô.

-  Dùng dao sắc cắt theo một hướng, sao cho đường cắt gọn, không bị dập nát

-  Kích thước của mảnh mô được cắt tùy theo kích thước của vật gá mẫu bệnh phẩm của máy cắt lạnh, thông thường kích thước 1 x 1 x 0,2 cm.

-  Số lượng mảnh cắt tuỳ từng trường hợp.

Làm lạnh mẫu bệnh phẩm và cắt, nhuộm mảnh mô

-  Đặt mẫu bệnh phẩm vào gá đúc lạnh rồi đưa ngay vào vị trí tương ứng trên thanh làm lạnh (Cryobar) trong buồng làm lạnh của máy, phủ gel cắt lạnh, xoay khối Head tracter đặt lên trên khuôn đúc chứa bệnh phẩm rồi đóng kín cửa kính phía trên buồng máy, chờ cho đến khi khối bệnh phẩm đông cứng (có màu trắng).

-  Mẫu mô sau khi đã đông cứng được cắt thành những lát thật mỏng. Bắt đầu cắt thô với độ dày từ 10-15 micromet để tạo mặt phẳng. Sau đó điều chỉnh độ dày  lát cắt từ 2-5 micromet. Quay  máy cắt với nhịp độ vừa phải.

- Kết hợp với chổi lông mềm dàn mảnh mô lên phiến kính.

-  Cố định mảnh mô: (để cấu trúc mô và tế bào giữ nguyên hình dáng và bắt màu thuốc nhuộm), sau khi lát cắt được dàn lên phiến kính, phải được cố định ngay bằng cồn tuyệt đối 95-960 hoặc cồn acetic-formol trong 20 giây.

-  Nhuộm mảnh mô: Có nhiều loại thuốc nhuộm khác nhau, mỗi loại có tính chất bắt màu nhân và bào tương khác nhau, tùy thuộc vào kinh nghiệm của từng cơ sở giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học để lựa chọn phương pháp nhuộm phù hợp. Tuy nhiên, vì yêu cầu của cắt lạnh để chẩn đoán nhanh, thời gian nhuộm ngắn, nên thuốc nhuộm thường dùng là xanh Toluidin, Diff-Quick, HE… Thời gian nhuộm từ vài chục giây đến 2 phút.

-  Sau khi đã lấy đủ bệnh phẩm cho cắt lạnh, cố định phần bệnh phẩm còn lại sau cắt lạnh (để xử lý, cắt, nhuộm thường quy - đối chiếu với chẩn đoán cắt lạnh và nhuộm đặc biệt nếu cần thiết).

-  Vệ sinh dụng cụ, máy cắt lạnh

Yêu cầu mảnh cắt: Mảnh cắt mỏng, phẳng, không bị nhăn hay gấp, bắt màu thuốc nhuộm rõ và đồng đều, độ tương phản tốt.

VI.  NHUỘM HEMATOXYLIN- EOSIN (HE) CÁC MẢNH CẮT MÔ

1.   NGUYÊN LÝ   

Đây là phương pháp nhuộm hai màu liên tiếp. Nhuộm nhân theo nguyên tắc tăng dần, nhuộm bào tương theo nguyên tắc giảm dần.

2. Thiêt bị, hóa chất

 2.1 Thiêt bị, hóa chất chung cho kỹ thuật

2.2. Thiết bị, hóa chất riêng biệt cho kỹ thuật

Phẩm nhuộm: Phẩm nhuộm nhân và bào tương có thể mua dạng thương mại, dùng luôn. Nếu không có sản phẩm dùng ngay, có thể pha phẩm nhuộm theo cách thức dưới đây:

a.                 Hematoxylin Harris :

-    Hematoxylin (tinh thể)                             1g

-   Cồn (etanol) tuyệt đối                              10ml

-   Alun (ammonium hay potassium)            20g

-   Nước cất                                                   200ml

-    Oxyt thuỷ ngân (đỏ)                                 0,5g

* Tiến hành pha :

1.           Hoà tan hematoxylin trong cồn.

2.            Hoà tan alun trong nước cất nóng. Đưa ra khỏi lửa và trộn hai dung dịch với nhau.

3.          Đun sôi hỗn hợp, kéo bình đun ra khỏi lửa và thêm vào dần oxyt thuỷ ngân.

4.           Đun nóng lại, khi hỗn hợp có màu tím sẫm, tắt lửa và nhúng ngay bình đun vào nước lạnh.

5.             Khi bình đun lạnh hẳn, thêm 2ml axit acetic lạnh để làm tăng tính nhuộm nhân.

b.           Eosine Y : ở Việt Nam thường pha dung dịch 0,5% trong cồn 95^o.

L.G. Koss pha theo công thức :

Eosine Y (CI. No 45830)             16g hoặc 1g Dichromat kali            8g hoặc 0,5g Axit picric 

                                                    160ml hoặc 10ml Cồn etanol 95^o      160ml  hoặc 10ml

Nước cất                                      1280 ml hoặc 80ml

-            Hoà tan eosin và dichromat kali vào nước cất, đun nóng nếu cần, sau đó thêm dung dịch axit picric, cồn.

3. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Cố định: Bệnh phẩm lấy ra khỏi cơ thể được đưa ngay vào dung dịch cố định (formol đệm trung tính 10%) với tỷ lệ thể tích dung dịch cố định nhiều gấp 20- 30 lần thể tích bệnh phẩm. Thời gian cố định từ 2-24 giờ tuỳ theo mảnh bệnh phẩm to hay nhỏ.

Sau khi cố định, bệnh phẩm được thực hiện qua các khâu kỹ thuật sau:

• Chuyển bệnh phẩm
• Vùi parafin
• Đúc khối parafin
• Cắt và dán mảnh cắt
• Nhuộm

Thực hiện các bước sau:

-        Tẩy parafin trong 3 bể toluen (hoặc xylen), mỗi bể 5 phút.

-        Qua 4 bể cồn: 100º - 95º - 80º - 70º, mỗi bể nhúng 15 lần.

-        Rửa nước cất: Nhúng 15 lần.

-        Nhuộm nhân bằng Hematoxylin Harris: 3-5 phút hoặc lâu hơn.

-        Rửa nước chảy: 5-10 phút.

-        Kiểm tra màu của nhân qua kính hiển vi, nếu đậm, tẩy nhẹ bằng cồn-axit.

-        Rửa nước chảy: 1phút.

-        Nhuộm Eosin1% : 1 -2 phút.

-        Rửa nước chảy: 1 phút.

-        Biệt hoá trong 2 bể cồn 95º - 100º, mỗi bể 15 lần nhúng.

-        Qua 3 bể toluen, bể I và II nhúng 15 lần, bể III: 5-10 phút.

-          Gắn lá kính

4. Yêu cầu kỹ thuật

Nhân tế bào                       xanh đến xanh đen

Bào tương tế bào               hồng đến đỏ

Hồng cầu                           hồng đậm

Sợi tạo keo                        hồng nhạt.